Низкие концентрации белка в плазме

[Larisunia]

Уважаемые, есть ли у кого опыт работы с реактивом Цоомассие Г250 (Метод Бредфорд) по определению очень низких концентраций белка в конечной надосадочной жидкости отмытых эритроцитов? Небольшая проблема с построением калибровочной кривой: не больно-то она прямая в диагностически-значимом диапазоне. Можно, конечно и "закат солнца вручную:ад:" сделать,но хочнтся по-правилам. Для калибровки использовался бычий сывороточный альбумин.

[Claudia812]

Возможно, Вам поможет найти информацию по этому методу то, что реактив называется "Кумасси" или "Камасси" (по-разному говорят в разных лабораториях).
Удачи и всего наилучшего!

[AlexPAR]

C кумасси G-250 я работал очень давно и только как с красителем для электофореза в полиакриламидном геле.
Ваша проблема не очень ясна.
В [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] сказано:реагент очень чувствителен к белку (1-2μg/ml). Все должно быть абсолютно чистым и
посуда и бумажный фильтр и кюветы и руки, иначе раствор посинеет и его можно будет вылить.
Калибровка в нужном диапазоне нелинейна, а хоть где-то она линейна (при других концентрациях)?
Для начала надо получить линейный участок калибровки. Мне нравится начиная с большой концентрации (заведомо определяемой), уменьшать ее вдвое последовательными разведениями.

[Dr.Vad]

Недавно пользовался этим методом для определения белка в цитратной плазме... калибровочные разведения были: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.3, 15.6 мкг/мл, в тесте рекомендуют делать и бланк (пустая проба с водой - дважды дистиллированной или деионизованной), и бланковые значения отнимать от всех стандартов и образцов. Все делал в дупликатах, в обычных координатах калибровочная была кривой, и только в логарифмических - прямой: R была 0.999 или 1.0 (если делать последнюю точку в калибровке "нулем", то логарифмические координаты не идут, поэтому лучше делать ее 0.5. 0.3, но не "0")

[Dr.Vad]

беглый обзор по качеству отмытых эритроцитов показывает, что содержание белка менее 1% от исходного - приемлемое качество отмывки, учитывая, что в цитратной крови его уровень 55-75 г/л (мг/мл) примерно на 10% ниже, чем в сыворотке, то оперировать Вам нужно в пределах 0.5-0.7 мг/мл или 500-700 мкг/мл, а значит в ультра-чувствительном диапазоне менее 10 мкг/мл Вам нужды нет?

[Larisunia]

[quote=Dr.Vad;1528296]
...беглый обзор по качеству отмытых эритроцитов показывает, что содержание белка менее 1% от исходного - приемлемое качество отмывки...

Хотелось бы ссылку на "беглый обзор". В ныне действующей нормативной документации (Постановление Правительства РФ от 26.01.2010г. № 29) нет понятия "исходная отмывка" и "приемлемое качество" и на этот счет вполне недвусмысленная информация дословно: не более 0,5 грамма в дозе. Если взять среднюю дозу 250 мл, то, соответственно, допустимое количество белка будет не более 2,0 грамм в литре.

...учитывая, что в цитратной крови его уровень 55-75 г/л (мг/мл) примерно на 10% ниже, чем в сыворотке, то оперировать Вам нужно в пределах 0.5-0.7 мг/мл или 500-700 мкг/мл, а значит в ультра-чувствительном диапазоне менее 10 мкг/мл Вам нужды нет?...

Нужда в чувствительном диапазоне все-таки есть, поскольку в конечной надосадочной жидкости как такового белка почти нет, только следы, которые можно детектировать лишь чувствительным тестом.

[Dr.Vad]

Saline-washed RBCs are units of whole blood or RBCs that have been washed with 1 to 2 liters of saline manually or in an automated cell washer. Washed units contain 10 to 20% less RBCs than the original units... These units have a hematocrit of 70% and have been depleted of 99% of the plasma proteins and 85% of the leukocytes. The residual potassium concentration is 0.2 mEq/L. Other RBC metabolites are almost entirely removed. Washing also removes cytokines that cause febrile reactions. Saline washed RBCs must be used within 24 h after washing since the original collection bag has been entered, which breaks the hermetic seal and increases the possibility of bacterial contamination...

[Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ]

примерно такое же описание встречал и в руководстве по трансфузиологии (есть в сети, не помню точно источник), в одной статье из 70-х средняя концентрация белка была 0.6%:
Data collected from 50 saline washed units of red blood cells shows that units washed with one liter of 0.9 per cent NaCl on an IBM cell processor have an average hematocrit of 72.2 per cent, with 84.7 per cent of the white blood cells removed, and only 0.6 per cent of the original total protein remaining. The red blood cell recovery is 85.5 per cent.
---
Тransfusion. 1976 Sep-Oct;16(5):464-8.
Use and analysis of saline washed red blood cells.
Wooten MJ.

Если правильно понял, в России требования пониже: 2 мг/мл белка составляет примерно 3% (если белок в плазме 70 г/л)... сколько раз Вы моете и какие конечные цифры получаются в среднем у Вас?

что значит "следы"? помнится, в моче следами называли значения белка менее 0.033 г/л = 33 мкг/мл, что далеко не чувствительный диапазон 1-10 мкг/мл, о котором вел речь...

[Larisunia]

С 1796 года мало что изменилось в процедуре отмывания и параметрах отмытых эритроцитов. Для отмывания также используем около 1 литра физ. раствора, гематокрит по норме должен быть 0,65-0,75, такой же получается на выходе. Но эти нюансы больше касаются производства, нежели лаборатории и проблем тут нет.
Меня больше волнует достоверный лабораторный результат. По результатам белок в окончательном взвешивающем растворе также укладывается в допустимый диапазон (не более 0,5 грамма в дозе), но график линейной зависимости все-таки не идеален. Калибровочные разведения (делала тоже в дублях): 1000, 500, 250, 100, 50, 25мкг/мл. По объективной причине (сыворотки с конц. 10мг/мл всего1 мл) не смогла долго эксперементировать. Пробовала использовать для этой цели альбумин со стандартной концентрацией 70г/л, но нужно очень солидно разводить, и, думаю, погрешность в этом случае была бы приличная. В следующий раз для кривульки использую "бланк" и попробую обработать в логарифмических координатах. Спасибо за умую мысль.

"Следами" я может быть некорректно и не научно назвала низкое содержание искомого аналита. Прошу прощения, если это так резко взрезало Ваш слух.

[Larisunia]

...Все должно быть абсолютно чистым и посуда и бумажный фильтр и кюветы и руки, иначе раствор посинеет и его можно будет вылить...

Чище не бывает:расходка исключительно одноразовая, работаем только в СИЗ, во время проведения реакции почти не дышим в сторону реактива, памятуя о его капризном характере, на кювету не жалеем родного 95% горючего.

...Калибровка в нужном диапазоне нелинейна, а хоть где-то она линейна ...
Линейна как раз при концентрации от 0,5г/л и выше, а мне надо от 0,5 и ниже.

...Для начала надо получить линейный участок калибровки. Мне нравится начиная с большой концентрации (заведомо определяемой), уменьшать ее вдвое последовательными разведениями...
И этот совет учту, спасибо.

[denson]

А чем вам не нравится метод с пирогаллоловым красным например? Там линейность будет где то от 0,01 до 2 г/л. Есть готовые наборы в продаже.

[AlexPAR]

Странно. В [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] про метод BRADFORD: Его основное достоинство - чувствительность; метод позволяет надежно определять по 10 до 100 мкг/мл белка. 10 мкг/мл в 50 раз меньше, чем 0,5 г/л. То есть запас метода для Вашей задачи большой.
Из [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] судя по наклону калибровки кумасси чувствительней чем пирогаллоловый. Там, впрочем, отдают предпочтение модификации сульфосалицилового метода.
Не знаю, что еще сказать.