Не получается с пирогалловым красным.

[AlexPAR]

Уважаемые коллеги, еще одна проблема.
Пытался поставить методику определения белка в моче с пирогаллоловым красным (Total protein UC FS, DiaSys) на б/х атоматическом анализаторе Марс (АРД 150, старая модель Витако). С калибровкой нормально, с воспроизводимостью - тоже. Но это в течение дня. На следующий день в воде может определиться 150мг/л. Ухлопал целую коробку, но ничего не добился. В соседней лаборатории эту методу тоже пытались внедрить, но отказались. Тут подробностей не знаю.
Руки у меня вроде не кривые. Марс? Это не японец, конечно, но другое, что я на нем пробывал или делал, идет нормально.
У кого-нибудь были такие проблемы?

[denson]

А оптическая плотность реагентного бланка (холостой пробы) как себя ведет - плывет?

[denson]

Пока выдалась минутка - напишу поподробнее.
Нам нужно:
1) ОП реагента безо всего. Если она плывет - виноват реагент
2) ОП и еще лучше всю реакционную кривую с деионизированной водой в качестве образца. Если реагент ОК, а с водой идет реакция, то это контаминация с иглы пробоотборника. Вы ж с сывороткой работаете, а там белка то ой-ё-ёй.
Опять же если белок попадает в реагент (с наконечника реагента), то тут рецепт один.
Делать белок в моче в начале дня на чистом анализаторе после ежедневной промывки, а сыворотку ставить уже после. Если и ежедневная промывка не спасает, то только после промывки хлоркой.
Если есть возможность, проделать все то же самое с отдельно стоящим фотометром, чтобы в этом случае быть уверенным, что вы ничего не контаминируете. Если и при этом ОП реагента плывет - реагент в помойку. Но скорее всего, что контаминация сывороткой у вас.

[AlexPAR]

По поводу ОП. По идее ОП реагента должна быть постоянна. Но вот два примера с большой разницей в ОП реагента, но хорошой воспроизводимостью в дубле.
№ конц A1 (реаг) A2 (смеси) A1-A2
5 1300__ 0,2604__ 0,4753___ 0,2149
5а 1300 _0,3401 __0,5535___ 0,2134
13 вода _0,3066 __0,2941__ -0,0125
13а вода 0,3508 __0,3395__ -0,0113


Я тогда на всякий случай просмотрел пропускание кювет и штуки три из работы исключил. Ничего не изменилось.
На анализаторе работают прихоящие врач б/х и лаборанты. Я свои изыски проводил обычно до них. Програмное обеспечение позволяет мне иметь отдельную независимую копию, с которой я работаю. При включении я провожу полную промывку, правда водой, и после выключения тоже.
Отработку проводил на калибраторе и ФСВОКовском мочевом образце.
Сегодня просматривая результаты, обнаружил, что Марс, похоже, неправильно обсчитывает отрицательые числа. Пересчитать разультаты не просто, т.к. не все фиксировал (иногда увеличивал в 2 раза объем пробы и т.п.). Придется дерзнуть еще раз.

Промывка. Я примерно раз в квартал промываю его Тритоном Х100. Коллеги из соседней лаборатории вроде используют Феери. От техников, которые приезжают для обслуживания, я не смог толком добиться, чем его надо промывать и чем дезинфицировать.
А Вы что посоветуете?

[AlexPAR]

Второго анализатора у нас нет. Можно конечно приобрести ручной специальный, но уж больно заманчиво использовать автомат, тем более что он у нас не надрывается.

[denson]

Так, а это один и тот же флакон реактива в разные дни? То есть ОП реагента нарастает. Ну тогда похоже что что-то попадает в реагент. С водой реакции нет. Пирогаллол красный - штука стабильная после открытия - это не пикринка.
По описанию конечно хочется первым делом анализатор промыть. Я лучше всего знаю наши Олимпусы, но во всех "хитачеподобных" анализаторах промывки примерно одинаковы: с детергентом промывки делаются каждый день, но правда из наконечников моется только пробоотборник. Промывка с гипохлоритом всего и вся (0,5% активного хлора) раз в неделю. А еще лучше чередовать промывку хлоркой и 1N HCl (если простую солянку достать геморно, ибо прекурсор, попробуйте купить фиксанал и его приготовить). В некоторых анализаторах на борт ставятся и щелочной и кислотный детергент одновременно. Еще хорошо бы реагентный носик протирать спиртом (каждый день, особенно если креатинин делаете). Мешалки кюветные (если они есть) тож спиртом раз в неделю.
Короче говоря, попробуйте хлоркой помыть анализатор да и еще раз посмотреть на поведение ОП реагента.

[AlexPAR]

Скорее всего в пробе 5 (1300) и 13 (вода) реактив из одного флакона, т.к. пробы делались с интервалом в 2 дня. 13 и 13а ( или 5 и 5а) - это результаты дубля пробы 13 (5) за один заход. Реально прибор выдает среднее (с возможностью просмотреть отдельно результаты каждого повтора, что я и показываю).
В течение дня ОП реактива меняется (как в приведенных примерах), при нормальных результатах, значения которых совпадают с ожидаемыми.

Попробую промыть, солянка у меня есть.
А кто-нибудь делает белок мочи на автомате?

[denson]

Различия во втором знаке после запятой - это сильно большой разброс, мне кажется. А может вам измерить ОП реактива в планшетном фотометре и ее воспроизводимость. И в дубле в один прием и потом, на следующий день например. Пирогаллол красный - это же 600 нм. Если в планшетнике есть фильтр, пусть даже и 620 или 630 - все равно понятно будет. Абсолютные цифры не сильно важны, интереснее, будет ли динамика. Капните пипеткой в пару тройку лунок.

А белок в моче на автоматах делают конечно - без проблем особых кстати. Как правило, проблемы все связаны с загрязнением сывороткой. Народ умудряется даже воткнуть пробирку с мочой среди сывороточных. Для этого нужно выставить две пробирки. В первую наливают детергент и заказывают ей пару любых тестов, чтобы чисто носик для образцов помыть, а во второй ставят мочу и преспокойно белок делают

[AlexPAR]

Сейчас я думаю, что скорее всего дело в контаминации. Это мне в голову даже не приходило, считал, что промывание пробоотборников (они же и перемешивают пробу) и кювет достаточное.
Динамику реактива на планшетнике я начал смотреть. На следующей неделе обязательно посмотрю кинетку с водой после биохимиков и после промывки.
Кюветы анализатора. Их износ разный. Первый анализ делается всегда в первой кювете. Рандомизации нет - технари говрили. И если анализов мало - то нагрузка идет на первые кюветы (посмотрю, кстати, воспроизводимость пробы (реагента и самой пробы) не в дубле, а в отдельных повторах, чтобы делалось в одной кювете).

[denson]

Если хотите, зайдите на сайт моей конторы. Там есть в открытом доступе инструкция к нашим БХ анализаторам AU и посмотрите раздел обслуживания. Примерное представление даст что и с какой частотой моется в анализаторе. Практически все то же самое верно и для Хитачи, Архитекта, Адвии, т.к. все это японский инжиниринг и сходная конструкция.
Кстати там же есть contamination avoidance параметры. По сути это программа доп промывок, которые делает анализатор для защиты от контаминации реактивами. Из нее можно понять что на что влияет и может загрязнить.
-http://www.beckmancoulter.com/EService/search/mediaFlexSearch.do?method=searchByProduct

[AlexPAR]

На Ваш сайт заходил, но мой английский слабоват.

Краткое изложение результатов.
На планшетном фотометре оптическая плотность реактива если и меняется, то в пределах его воспроизводимости.
На марсе первое (и часто второе) определение белка в воде дает высокое значение. Последующие результаты в воде - нормальные. В калибраторе (1300) первое и второе измерение не выделяется по сравнению с последующими.
Явно версия с загрязнением самая правильная.
Промывка кислотой перед анализами (точнее две незавершенные промывки - в режимах штатной дизинфекиции и промывки виснет, не дорабатывая до конца) - не оказала ни какого благаприятного влияния.
Проведение пары б/х анализов в сыворотке между анализами белка в воде, как ни странно, не вызвало повышения результатов в воде.
Еще попробую вариант с детергентом в пробе.

[denson]

Ндаа. Засыхает оно что ли за ночь и при первых промывках отмывается Интересно за ночь какие нибудь бактерии могут нарости и давать реакцию на белок?
Кстати наши анализаторы в штатном режиме после нажатия кнопки старт сначала моют пробоотборник в детергенте 5 раз по моему (он ставится на борт в специальную позицию) потом раз 10 моет водой, делает промывочный цикл кюветам, и только после этого начинает брать образцы в уже только что отмытую и высушенную кювету.

[AlexPAR]

Марс тоже во время работы после каждого анализа идет плановая промывка,циклы не считал.
Странно, что после полной промывки перед работой водой надо сделать несколько анализов вхолостую, чтобы выйти на рабочий режим.
Тритоном Х100 я промываю нештатно: помещаю заборник из канистры с водой в стакан (рекомендация технарей - штатный не работает) с Х100 и прошу промыть кюветы, дозаторы, прокачать систему. Потом заменяю Х100 на воду пару раз и опять в канистру. Вариант не лучший, но другого нет. В штатном режиме промывающие растворы ставятся в специальные позиции.

[AlexPAR]

Делал с белок в моче с пиррагалловым параллельно с CLINITEK Status. В целом коррелирует, но дает много анализов со слегка повышенным белком.
Проблема действительно в загрязнении ячеек и заборников, но решить ее на данном автомате не смогли. От дальнейших попыток пока отказались.

[ClinlabSamara]

Метод не подходит для работы на автоматических анализаторах:
1. С многоразовыми кюветами
2. Без возможности программирования дополнительных циклов промывки игл.