Вопросы лаборат. диагностики микоплазменной (уреаплазменной) и хламидийной инфекции.

[dr_edde]

Краткая предыстория вопроса:

В нашей дискуссии (http://forums.rusmedserv.com/showthr...&threadid=2474) и на своем интересном сайте ([Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ]) доктор В. Дворянчиков выссказывает несколько спорных, с моей точки зрения, соображений по поводу диагностики микоплазменной (уреаплазменной) и хламидийной инфекции.

Мне бы искренне хотелось прояснить эти спорные моменты…
В связи с этим возникли вопросы к доктору Дворянчикову:
1. На своем сайте ([Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ]) в разделе «Лабораторная диагностика. Культуральный метод.» Вы пишете: “Культуральный метод считается "золотым стандартом" с условной чувствительностью - 100% (в действительности - не более 80%).”. По отношению к какому методу вы рассчитываете чувствительность культуралного метода?
2. Как вы оцениваете вероятность появления в мазке(соскобе, биоптате) взятом с целью цитологической диагностики хламидиоза (микоплазмоза) исключительно не пораженных указанными микроорганизмами клеток, при том что клетки пораженные хламидиями/микоплазмами в организме больного все-таки будут присутствовать? Какова эта вероятность по вашему и как вы ее оценивали?
3. Разработанный Вами метод окраски подходит только для определенных эпителиальных клеток (плоский эпителий) или всех видов клеток?
4. Насколько видоспецифичен ваш метод окраски?
5. Могут ли вашим методом прокрашиваться клеточные органеллы (митохондрии, элементы цитоскелета) близкие к микоплазмам/хламидиям по форме и размеру? Каким образом вы это установили?
6. Какова чувствительность вашего (цитологического) метода диагностики хламидиоза (микоплазмоза) в сравнеии с «золотым стандартом» (культуральный метод)?

[V.Dvorianchikov]

"1. По отношению к какому методу вы рассчитываете чувствительность культуралного метода?"
Это без меня рассчитали (там должна быть ссылка, если нет могу отыскать источник).

"2. Как вы оцениваете вероятность появления в мазке(соскобе, биоптате) взятом с целью цитологической диагностики хламидиоза (микоплазмоза) исключительно не пораженных указанными микроорганизмами клеток...?"
Если вы обратили внимание, наша методика отбора материала принципиально отличается от общепринятой. Связано это с тем, что соскоб (биоптат) часто (особенно у мужчин) берется вслепую, и в нем, действительно, могут оказаться только здоровые (не инфицированные) клетки. Мы же используем исключительно мазок, спекулируя на том обстоятельстве, что пораженные цельные клетки отторгаются значительно интенсивнее, чем не пораженные. При этом, в мазке оказывается несколько сотен или тысяч цельных клеток (против десятков или сотен в "здоровом" мазке, смотря по месту отбора), часть из которых обязательно будет содержать цитопаразита, если инфекцонный очаг имеет свободный выход в полость, из которой отбирается материал.

"3. Разработанный Вами метод окраски подходит только для определенных эпителиальных клеток (плоский эпителий) или всех видов клеток?"
Для любых клеток эукариот.

"4. Насколько видоспецифичен ваш метод окраски?"
Опытный лаборант, в принципе, различает виды по форме колоний и оттенкам, но для нашей работы это не имеет практического значения. Кроме того, ввиду высокой мутабельности этих микроорганизмов, всегда имеется вероятность неправильного соотнесения.

"5. Могут ли вашим методом прокрашиваться клеточные органеллы (митохондрии, элементы цитоскелета) близкие к микоплазмам/хламидиям по форме и размеру? Каким образом вы это установили?
"
Нет. Прокрашиваются только мембраны и ядерный материал. Мембраны здоровых клеток окрашиваются слабо. Различия легко видеть.

"6. Какова чувствительность вашего (цитологического) метода диагностики хламидиоза (микоплазмоза) в сравнеии с «золотым стандартом» (культуральный метод)?"
Смотря по объекту культивирования. С хламидиями не сравнивали. Микоплазм/уреаплазм мы находим заметно чаще (и клиника это подтверждает). Но изредка случается, что посев выявляет, а мы нет.

[dr_edde]

Это без меня рассчитали (там должна быть ссылка, если нет могу отыскать источник).

Ссылки там нет... буду благодарен за ссылку на источник.

Если вы обратили внимание, наша методика отбора материала принципиально отличается от общепринятой. .... если инфекционный очаг имеет свободный выход в полость, из которой отбирается материал.

Но я не случайно спрашивал: "Какова эта вероятность по вашему и как вы ее оценивали?" Из того что Вы ответили следует, что Вы вероятность ложноотрицательного анализа не оценивали ни как, вы просто предполагаете, что в следствии изменении методики забора образца эта вероятность будет низкой? Какой? А если очаг не имеет свободный выход в полость? Кстати, в Вашей "Инструкции для иногородних (иностранных) пациентов по самостоятельному отбору и отправке мазков" я не нашел каких-то серьезных отличий от общепринятой методики. Например для получения материала из уретры мужчин Вы рекомендуете делать "отпечаток". По моему ясно, что инфицированные клетки попадут на стекло в этом случае только при условии наличия обильных выделений из уретры? Зато, уверяю Вас, если Вашу инструкцию по "изготовлению стерильного аппликатора из макияжной палочки" прочтут представители санэпидемстанции, им это очень не понравиться.

Опытный лаборант, в принципе, различает виды по форме колоний и оттенкам, но для нашей работы это не имеет практического значения. Кроме того, ввиду высокой мутабельности этих микроорганизмов, всегда имеется вероятность неправильного соотнесения.

Тоесть видовую принадлежность микоплазм вы не определяете? А микоплазмы и хламидии Ваш метод различает?

Нет. Прокрашиваются только мембраны и ядерный материал. Мембраны здоровых клеток окрашиваются слабо. Различия легко видеть.

Глядя на картинку под названием "Эпителиоцит, инфицированный хламидиями (в центре). Клетки вокруг не инфицированы. Объектив-90х." я бы не сказал, что там окрашена только мембрана и ядро. Тоесть вы избирательно окрасили митохондрии (эндоплазматический ретикулум) в пораженной клетке, затем применили свой метод окраски и ни одного совпадения не нашли?

Смотря по объекту культивирования. С хламидиями не сравнивали. Микоплазм/уреаплазм мы находим заметно чаще (и клиника это подтверждает). Но изредка случается, что посев выявляет, а мы нет.

Вы первый человек из знакомых мне, который пытается рассчитывать чувствительность дополнительного (лабораторного, параклинического) метода исследования исходя из данных клиники. Вам не кажется, что это тупиковый путь, тем более в бактериологии? И почему вы не приводите конкретных цифр? «Изредка» и «Заметно» это сколько? В 1% или, может быть, в 50%? Интересно как Вы объясняете, что вы заметно чаще находите микоплазм и уреаплазм, чем культуральный метод?

[V.Dvorianchikov]

"Ссылки там нет..."
Ладно. Поищу, когда буду дописывать странцу.

"Из того что Вы ответили следует, что Вы вероятность ложноотрицательного анализа не оценивали ни как, вы просто предполагаете, что в следствии изменении методики забора образца эта вероятность будет низкой? Какой? А если очаг не имеет свободный выход в полость?"
Если у ПИФ ложноотрицательность 2-3%, то у нас и того меньше. Или вас интересуют доли процента? Если же очаг не имеет выхода в полость, то, как говориться, ловить нечего - ни МОМ, ни ПЦР, ни посевом.

"Тоесть видовую принадлежность микоплазм вы не определяете? А микоплазмы и хламидии Ваш метод различает?"
Если завтра возникнет необходимость различать виды - найдем способ различать. Сейчас такой проблемы нет. Тем более, что подавляющее большинство наших пациентов приходят к нам с анализами "со стороны" и по завершение леченя вновь бегут на ту же "сторону" за подтверждением результативности.
А чтобы не отличить микоплазму от хламидии, надо очень много выпить.

"...я бы не сказал, что там окрашена только мембрана и ядро."
Митохондрии, конечно, имеют мембраны, которые тоже могут слегка окрашиваться, но это не влияет на выявление хламидий и микоплазм. Сероватый фон в данном случае - не митохондрии и не микоплазмы, а оптический артефакт, связанный с деформацией клетки. При рассмотрении реального изображения, можно прекрасно различить, где что.

"Вам не кажется, что это тупиковый путь, тем более в бактериологии? И почему вы не приводите конкретных цифр? "
Тупиковый путь - рассчитывать, что всё посеянное прорастет, а все содержащее ДНК даст полимеразную реацию. Тут же просто: микроб либо виден, либо нет. Спутать его не с кем - слишком характерный вид. Клиника вполне отчетливая, великолепно коррелирует с микроскопией. Лечение безвредное. Результаты лечения оцениваются стандартными дебильными методами, что нас, в общем-то устраивает: если какой-нибудь недолеченный психопат начинает бузить, что лечение затягивается, мы посылаем его проверяться, куда он пожелает, а когда он приносит хороший результат, долечиваем его уже под видом нормализации микрофлоры. Все счастливы.
Конкурентов у нас нет и в ближайшие годы не предвидется. Чего еще желать? И для чего рвать когти и выбрасывать на ветер деньги? Чтобы кому-то доказать что он балбес? Так он и сам это подозревает. Гладко-то, ведь, только на бумаге. Так чего ее бестолку марать? От добра добра не ищут.

[dr_edde]

Если у ПИФ ложноотрицательность 2-3%, то у нас и того меньше. Или вас интересуют доли процента? Если же очаг не имеет выхода в полость, то, как говориться, ловить нечего - ни МОМ, ни ПЦР, ни посевом.
Вы сами на [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] пишите, что ПИФ на хламидии имеет чувствительность, по разным данным, от 55% до 95%. Следовательно процент ложно отрицательных результатах должен быть, как минимум, от 5 % до 45 %. Если говорить о % ложноотрицательных результатов Вашего цитологического метода диагностики, то в случае хламидийной инфекции Вам он неизвестен, т. к. Вы, как писали выше, не проводили его сравнения с даже культуральным методом, а в случае микоплазменной инфекции, резко большее количество положительных результатов, чем в посеве, и, вместе с тем, наличие некоторого количества явно ложноотрицательных результатов, с моей точки зрения, говорит о гипердиагностике. Почему бы Вам не сравнить Ваш метод с ПЦР? Я думаю, что в случае такого сравнения выявилась бы масса случаев, когда Вы бы видели "пораженные" соответствующими микроорганизмами клетки в которых полностью отсутствует генетический материал этих микроорганизмов. В гипотетическом случае, когда очаг хламидийной или микоплазменной инфекции не выходит в какую-либо полость, а также, тогда когда локализация очага/очагов неизвестна (также как и в случае скрининговых исследований) все-таки хорошие результаты дает серологический метод диагностики (обнаружение антител к соответствующим микроорганизмам с помощью ИФА или другого метода). Метод дает полезные результаты в случае использования [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ], а в случае диагностики хламидиоза только при использовании видоспецифических антител. Серологическая (а в равной степени и ПЦР) диагностика хламидийной инфекции основана на наличии в [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] гомологичных (для видов, родов, семейств и т. д.) и устойчивых участков, которые обуславливают, в том числе, и их антигенную структуру. [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] можно найти более подробную информацию по использованию серологического метода диагностики хламидийной и микоплазменной инфекции. [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] мы поместили [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] в которой на большом материале сравниваются различные методы диагностики микоплазменной и хламидийной инфекции.
Митохондрии, конечно, имеют мембраны, которые тоже могут слегка окрашиваться, но это не влияет на выявление хламидий и микоплазм. Сероватый фон в данном случае - не митохондрии и не микоплазмы, а оптический артефакт, связанный с деформацией клетки. При рассмотрении реального изображения, можно прекрасно различить, где что.
Напомню, что по [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] хламидии имеют размеры 0.15 – 0.3 мкм (по другим данным 0,25 – 1 мкм) а микоплазмы 0,3 – 0,8 мкм и длину до 150 мкм. Митохондирии имеют размеры в среднем 0,5 Х 0,5 – 60 мкм. Митохондрии также как и обсуждаемые микроорганизмы могут иметь гранулярную и нитевидную формы. Так как же вы их дифференцируете? А если мембрана клетки разрушена (что чаще всего и происходит со многими клетками полученными для цитологической диагностики с помощью соскоба)? Что Вами окрашивается в этом случае?

Тупиковый путь - рассчитывать, что всё посеянное прорастет, а все содержащее ДНК даст полимеразную реацию.
Все живое и аккуратно посеянное на соответствующую питательную среду обязательно «прорастет», а содержащее ДНК гомологичное праймеру(специфическому фрагменту ДНК, который инициирует полимеразную цепную реакцию) несомненно даст полимеразную цепную реакцию (ПЦР)! Кстати, проблема с «мертвой днк» (т. е. ДНК, принадлежащей мертвым, случайно попавшим в организм микроорганизмам) решается либо повторным анализом через 2-4 недели, либо использованием ПЦР в режиме реального времени (Real Time PCR), которая позволяет определять КОЛИЧЕСВО ДНК/РНК инфекционного агента в анализируемом материале.
Тут же просто: микроб либо виден, либо нет. Спутать его не с кем - слишком характерный вид.
Я не микробиолог, но предполагаю, что найдется масса внутриклеточных паразитов с очень похожей морфологией.

[V.Dvorianchikov]

Разумеется, это опечатка: 2-3% для ПИФ это ложноположительность. Статьи, по глупости или злому умыслу авторов превозносящие ИФА и т.п., простите, читать не стану - притомило.

Митохондрии, в отличие от микоплазм не сидят на мембранах. Разрушенные клетки не имеют особой информативности. В мазке довольно и целых.


"Все живое и аккуратно посеянное на соответствующую питательную среду обязательно «прорастет», а содержащее ДНК гомологичное праймеру(специфическому фрагменту ДНК, который инициирует полимеразную цепную реакцию) несомненно даст полимеразную цепную реакцию (ПЦР)! "
Щас! А конкурирующие микроорганизмы (или их эндотоксины), а ингибиторы полимеразы...?

"Я не микробиолог, но предполагаю, что найдется масса внутриклеточных паразитов с очень похожей морфологией."
Например?

[dr_edde]

Щас! А конкурирующие микроорганизмы (или их эндотоксины)
Давно придумали селективные среды! А эндотоксинов много надо, что не растет на селективной среде, то не вырабатывает эндотоксин…
, а ингибиторы полимеразы...?
Для диагностики ЗППП какие, например?
По поводу моего предположения о внутриклеточных паразитов со сходной с хламидиями/микоплазамами морфологией спросим микробиологов, если они здесь появятся???

[dr_edde]

Статьи про серологическую диагностику (ИФА) зря читать не стали. Никто ИФА не превозносит! Это такой же метод диагностики(не [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] !), как и все другие, со своими достоинствами и недостатками. Очевидными достоинствами его является возможность отследить иммунный ответ организма и отсутствие необходимости забора материала непосредственно из очага инфекции. И есть [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ], которые позволяют с высокой степенью достоверности дифференцироать стадии инфекционного процесса (острая, хроническая, реинфекция, реконвалесценции). Раньше где-то читал, что корректно произведенное ИФА-исследование на хламидии обладает чувствительностью на уровне 80-90% (по сравнению с культуральными методом исследования).
Посмотрел картинки на [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] с опытным цитологом. Мы сошлись во мнениях, что на всех представленных Вами фотографиях все включения находятся ВНУТРИКЛЕТОЧНО.

[V.Dvorianchikov]

Давайте оставим тему антител. Метод ИФА (впрочем, как и другие молекулярные и генетические) в отношении этих микроорганизмов порочен уже тем, что они имеют весьма малый геном, а потому непредсказуемо мутабельны.
Если вы с цитологом смотрели снимки хламидий, то, естественно, ретикулярные тельца расположены внутриклеточно. Если же микоплазм, то обратите внимание на снимок эпителиоцита при перикардите. Эпимембранное расположение микоплазменных гранул на нем видно абсолютно отчетливо.

[dr_edde]

Давайте оставим тему антител. Метод ИФА (впрочем, как и другие молекулярные и генетические) в отношении этих микроорганизмов порочен уже тем, что они имеют весьма малый геном, а потому непредсказуемо мутабельны.
Во первых из того, что микроорганизмы имеют весьма малый геном не следует то, что они должны быть обязательно «непредсказуемо мутабельны».
Во вторых, если, следуя вашей логике, хламидии и микоплазмы настолько мутабельны, что даже метод ПЦР их не может с необходимой достоверностью различить, то Вам следует признать, что и Ваш цитологический метод тоже не даст достоверной информации. Чем по вашему обусловлена морфология микроорганизма, если не его геномом?
На фотографии: [Ссылки доступны только зарегистрированным пользователям ] видно, что одна из везикул располагается близко к мембране, но, очевидно, с внутренней ее стороны!
Раз вы признаете, что ретикулярные тельца хламидий располагаются внутриклеточно, значит их все-таки можно спутать с митохондриями???
Кстати, выше Вы утверждали, что Вашим методом «Прокрашиваются только мембраны и ядерный материал». Ретикулярные тельца хламидий это не мембраны (во всяком случае это не мембраны клеток)! Потом писали, что «Митохондрии, конечно, имеют мембраны, которые тоже могут слегка окрашиваться» Так когда вы писали правду? Как вы определяли избирательность окраски?

[dr_edde]

И ответьте, пожалуйста, какие ингибиторы полимеразы, по вашему, могут мешать выявлению возбудителей ЗППП методом ПЦР?